07月03 【成功案例】通過轉(zhuǎn)錄組研究合浦珠母貝異種異體移植大珠母貝的免疫抑制反應(yīng)
Transcriptome analysis of the immune reaction of the pearl oyster Pinctada fucata to ?xenograft from Pinctada maxima
雜志：Fish & Shell?sh Immunology
影響因子：3.148
PMID:?28606863
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- 研究背景
大珠母貝（P. maxima）通過同種異體移植的方法進行培養(yǎng)面臨很大的困難，而對于合浦珠母貝（P. fucata）而言，同種異體移植培養(yǎng)較容易實現(xiàn)。如果合浦珠母貝可以作為孕育受體去培養(yǎng)大珠母貝珍珠，將有益于大珍珠培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。移植后的免疫抑制反應(yīng)是阻礙該產(chǎn)業(yè)前行的一大障礙。據(jù)前期的研究統(tǒng)計，珠母貝通過異種異體移植的存活率約在6.3%-15.4%之間。人體器官異種異體移植的免疫反應(yīng)已有相關(guān)報道；在軟體動物中，異種異體移植的免疫抑制反應(yīng)也有報道；但是在珠母貝免疫反應(yīng)研究中，僅有一項通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對珠母貝同種異體移植免疫抑制反應(yīng)的研究。
- 研究目的
此項研究希望通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對合浦珠母貝異種異體移植后免疫分子變化進行探索，尋找對抗宿主珠母貝免疫抑制反應(yīng)的策略。
- 材料方法
?3.1實驗材料
大珠母貝，合浦珠母貝
實驗組：
同種組：合浦珠母貝植入合浦珠母貝地幔片
異種組：合浦珠母貝植入大珠母貝地幔片
對照組：合浦珠母貝
實驗組分別取手術(shù)后不同時期的宿主珠母貝（0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h和?96 h）血淋巴，?Control組收集宿主珠母貝的血淋巴（0h），共15個樣本，分別進行RNA提取。
?3.2測序方法和數(shù)據(jù)量
測序平臺：Illumina Hiseq?2500 platform
總計得到107.93Gb的clean reads，平均每個樣本7.1Gb的數(shù)據(jù)。
3.3分析方法
所有分析在百邁客云平臺完成（BMK Cloud?：http://www.dfhjdf.cn/）。
主要分析：
a．數(shù)據(jù)質(zhì)控 （去接頭，去低質(zhì)量的序列）；
b．利用合浦珠母貝參考基因組進行組裝；
c．與數(shù)據(jù)庫比對（NR、Swiss-Prot 、GO 、COG 、KOG 、Pfam 和KEGG）注釋；
d．差異表達基因分析（GO分析、KEGG通路富集）。
4.技術(shù)路線
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5.實驗結(jié)果
5.1轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
分別對14個實驗組和1個對照組樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序數(shù)值如表1所示，每個樣本的Q30都在91.42%以上，GC含量在42.19%和45.38之間。
5.2?差異表達基因分類和功能注釋
分別將各個時期（0h、6h、12h、24h、48h、72h、和96h）同種異體移植組（M組）和異種異體移植組（B組）基因表達量進行比對，獲得各個時期的差異表達基因，在0h，獲得的差異表達基因最多，共2265個，其中1097個上調(diào)，1168個下調(diào)（FDR﹤0.05，log2 ratio ≥1）。
圖1.不同時期差異表達基因
將每個時期的差異表達基因進行GO分類，獲得45-49個子分類，根據(jù)GO的三大功能類別(cellular component,molecular function和biological process)分析，大多數(shù)免疫相關(guān)的基因被富集到biological process這一類。
通過KEGG通路富集分析，各個時期的差異表達基因分別富集到148（M0/BO），106（M6/B6），99（M12/B12），92（M24/B24），73（M48/B48），123（M72/B72），和96（M96/B96）個通路中。
5.3異種異體移植引起的免疫相關(guān)差異表達基因
為了鑒定這些差異表達基因參與的免疫路徑，探索異種異體移植引起的基因表達具體變化，研究人員通過GO富集將各時期的同種移植和異種移植免疫反應(yīng)相關(guān)差異表達基因分成不同的功能類別（P≤0.05），在M0/B0組中，細胞循環(huán)，NADH脫氫酶活性等相關(guān)基因顯著富集，其中一些與免疫學(xué)過程相關(guān)；在M12/B12組中，有大量的氧化還原過程和調(diào)控細胞轉(zhuǎn)移的unigenes，它們可能參與血球細胞的轉(zhuǎn)移和吞噬；通過數(shù)據(jù)分析得到，48h和72h中，損傷修復(fù)是重要的term，它與免疫反應(yīng)最相關(guān)；在96h，細胞凋亡是重要的term。
結(jié)合KEGG通路富集分析，在M0/B0的比對中發(fā)現(xiàn)，核糖體，氧化磷酸化和GPI錨等相關(guān)路徑被顯著富集。在M6/B6比對中，有9個顯著富集的通路，包括細胞凋亡、拼接體和MAPK信號通路等，且大多數(shù)通路與免疫功能相關(guān)；值得注意的是MAPK信號通路在6h、24h、72h和96h組多次出現(xiàn)并且顯著富集。MAPK信號通路和其他免疫相關(guān)通路富集，可能是該研究中描述同種異體移植和異種異體移植免疫反應(yīng)差異的一個好起點。
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圖2.不同時期差異表達基因GO富集圖
通過unigene聚類分析鑒定了不同時間點的免疫相關(guān)基因：在0h，參與氧化還原反應(yīng)的基因（包括NADH脫氫酶1、細胞色素c氧化酶1等）在異種異體移植中上調(diào)；在6h，熱休克蛋白70、熱休克70kDa蛋白等在異種異體移植中比同種異種中表達量高；在12h，NADH脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶在異種移植中高表達；
研究人員通過GOterm分析檢測到參與氧化還原反應(yīng)的表達基因，在24h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植中大量表達；在48h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和熱休克蛋白70在異種異體移植中大量表達；在72h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植組中表現(xiàn)出下調(diào)；96h，熱休克蛋白70和TNF受體關(guān)聯(lián)因子6繼續(xù)在異種異體移植中高表達，表明免疫反應(yīng)依然存在。
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圖3.不同時期unigene聚類熱圖
5.4移植引起的差異表達基因鑒定
將兩個實驗組分別與對照組進行比對后，再將比對后的同種異體移植與異種異體移植進行比對。獲得不同時期（ 0h/6h/12h/24h/48/72h/96h）的差異表達基因分別為518，814，807，710，689，700，832個。
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圖4.兩實驗組與對照組比對韋恩圖
通過KEGG通路富集分析，河馬信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、 MAPK信號通路、核糖體等通路顯著富集。許多基因在實驗組高表達，在對照組表達量較低，細胞異常死亡蛋白1和蛋白激酶7在對照組中表達量較高，但是在實驗組中幾乎不表達，說明這些差異表達基因是由移植引起 。
6.RT-PCR驗證
從不同表達水平中隨機選擇10個與免疫相關(guān)差異表達基因進行qRT-PCR實驗，實驗結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果基本一致，證明了本實驗中的差異基因表達譜準確可靠。
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圖5.RT-PCR驗證
7.結(jié)論
綜上所述，無論在同種移植還是異種移植，免疫抑制都是重要的免疫反應(yīng)。細胞凋亡、河馬信號通路、氧化還原作用、MAPK信號通路、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、嘌呤新陳代謝、NF-kappa B 信號通路、氧化磷酸化、Ras 信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解參與了移植應(yīng)答反應(yīng)。NADH脫氫酶、HSP70、細胞凋亡蛋白酶-7分別在氧化還原反應(yīng)，MAPK信號通路和細胞凋亡途徑表現(xiàn)出不同的表達量?？梢酝茰y氧化還原反應(yīng)很可能是移植后免疫抑制反應(yīng)中的關(guān)鍵因素。這些發(fā)現(xiàn)有助于闡明異種異體移植免疫抑制反應(yīng)的分子機制，也有益于珠母貝異種移植免疫抑制試劑的開發(fā)。
8.創(chuàng)新點
通過珍珠貝同種移植和異種移植差異表達基因的比較研究，尋找異種異體移植免疫抑制中的關(guān)鍵影響因素，開辟了珍珠貝異種異體移植研究的新方向。